一、產(chǎn)品背景

在研究項(xiàng)目中，當(dāng)向外部來(lái)源運(yùn)送樣本或從外部來(lái)源運(yùn)送樣本時(shí)，或者需要在不同時(shí)間收集樣本時(shí)，或者僅僅是當(dāng)樣本不能一次全部處理時(shí)，通常需要儲(chǔ)存新鮮器官和固體組織樣本。在這些情況下，短期儲(chǔ)存可以充分靈活地在幾天內(nèi)對(duì)組織進(jìn)行進(jìn)一步處理。為了從儲(chǔ)存的組織中分離活細(xì)胞，必須避免在儲(chǔ)存期間出現(xiàn)壞死和凋亡。此外，必須防止細(xì)胞活化，以及細(xì)胞多能性的變化，以保持細(xì)胞的生理和功能狀態(tài)。一種常見(jiàn)的儲(chǔ)存方法是冷凍組織樣本，但這經(jīng)常導(dǎo)致解凍后的細(xì)胞死亡率很高，并且對(duì)運(yùn)輸構(gòu)成挑戰(zhàn)。

為了克服所有這些問(wèn)題，美天旎專(zhuān)門(mén)開(kāi)發(fā)了MACS組織保存液，它可以在2-8°C下將新鮮固體組織最佳儲(chǔ)存至少48小時(shí)。在此存儲(chǔ)期內(nèi)，細(xì)胞的活力、功能和激活狀態(tài)得以保存，并防止細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)基因的誘導(dǎo)。MACS組織保存液已經(jīng)過(guò)多種人類(lèi)和小鼠組織的測(cè)試，包括腫瘤、肺、脾、腦和骨骼肌。

二、材料與方法

1. 腫瘤儲(chǔ)存

收集小鼠CT26腫瘤并切成大小相似的塊。將等量的腫瘤切片分別放入裝有5 mL MACS組織保存液的兩個(gè)15 mL試管中，于2-8℃保存24和48小時(shí)。在每個(gè)zhi定的時(shí)間點(diǎn)，新鮮和儲(chǔ)存的腫瘤片以相同的方式處理。

2. 腫瘤分離

使用帶加熱器的gentesmacs™ Octo解離器和Tumor Dissociation Kit, mouse根據(jù)說(shuō)明書(shū)解離腫瘤。解離后，獲得的單細(xì)胞懸浮液使用MACS Smart Strainers(70µm)過(guò)濾。其中一部分細(xì)胞用于流式細(xì)胞術(shù)分析，其余細(xì)胞保存在RLT緩沖液(Qiagen)中，待進(jìn)一步處理用于基因表達(dá)分析。

3. 流式細(xì)胞術(shù)分析

使用以下抗小鼠RE Afinity®抗體流式細(xì)胞術(shù)分析TIL群體:CD45 (REA737)、CD3 (REA614)、CD25 (REA568)、CD69 (REA937)、CD4 (REA604)、CD8a (REA601)、CD19 (REA749)、CD80 (REA983)和CD86 (REA1190)。使用MACSQuant®Analyzer 10對(duì)樣品進(jìn)行分析。碘化丙啶用于排除死細(xì)胞。死細(xì)胞排除后，從門(mén)控CD45+活細(xì)胞中分析TIL群體。

4. 基因表達(dá)分析

使用RNeasy®Mini Kit (Qiagen)從新鮮和儲(chǔ)存的細(xì)胞中分離RNA。使用Qiagen公司的RT2第一鏈試劑盒(RT2 First Strand Kit, Qiagen)生成cDNA，并使用Qiagen公司的RT2 Profiler®PCR陣列(Stress and Toxicity PathwayFinder®，小鼠)和GeneGlobe®分析工具分析基因表達(dá)。

三、結(jié)果

MACS組織保存液可保存細(xì)胞活力和TIL群體組成長(zhǎng)達(dá)48小時(shí)，CT26腫瘤在收集當(dāng)天或在MACS組織保存液中儲(chǔ)存24和48小時(shí)后處理。分離后，流式細(xì)胞術(shù)分析TILs的總細(xì)胞活力和組成。在新鮮和儲(chǔ)存的樣品中，細(xì)胞活力均超過(guò)85%(圖1A)。此外，TILs的組成也隨著時(shí)間的推移而保持不變(圖1B)。通過(guò)分析活化標(biāo)記CD25、CD69、CD80和CD86在特定TIL群體中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的活化狀態(tài)也得以保存。

圖1:CT26小鼠腫瘤在MACS組織中4°C保存

儲(chǔ)存液24或48 h。解離后，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞總活力(A)和TIL組成(B)。細(xì)胞頻率參照活細(xì)胞CD45⁺。另外，CD3⁺和CD19⁺細(xì)胞子集的頻率分別指對(duì)應(yīng)的親本CD3⁺和CD19⁺群體。

在MACS組織保存液中，細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)被阻止，分子分析的主要關(guān)注點(diǎn)是儲(chǔ)存條件誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激和基因表達(dá)的變化。這是通過(guò)分析細(xì)胞應(yīng)激途徑相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)研究的。將儲(chǔ)存樣品的基因表達(dá)與新鮮樣品進(jìn)行比較。在儲(chǔ)存24或48小時(shí)后，細(xì)胞中未觀察到細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生重大變化，基因表達(dá)與新鮮樣品細(xì)胞相當(dāng)(圖2)。

圖2:新鮮腫瘤和儲(chǔ)存腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)情況。從新鮮和儲(chǔ)存的CT26腫瘤細(xì)胞中分離RNA，分析細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)。熱圖顯示了與新鮮組織相比表達(dá)率的倍增變化。

四、結(jié)論

•  MACS組織保存液是一種強(qiáng)大而方便的解決方案，適用于不同組織樣品和器官的短期儲(chǔ)存。

•  細(xì)胞活力、細(xì)胞成分和細(xì)胞激活狀態(tài)可保存至少48小時(shí)。

•  最后，MACS組織保存液可以防止細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，因?yàn)榕c新鮮樣品材料相比，細(xì)胞應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平的變化保持在最di水平。

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